牛乳腺上皮細胞中bta-miR-145功能的初步研究

牛乳腺上皮細胞中bta-miR-145功能的初步研究

作者:師大云端圖書館 時間:2015-10-29 分類:參考文獻 喜歡:3231
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【摘要】乳腺是動物成年后經歷增殖、分化、凋亡的唯一器官。奶牛乳腺發育和泌乳機理的研究對提高奶牛的生產性能及乳品質非常重要。microRNAs是一類在轉錄后調節基因表達的短的非編碼RNA。從microRNA的角度研究其對奶牛乳腺發育和泌乳機理的調控是一個較新的研究領域。本試驗選取在奶牛分娩前后有差異表達的bta-miR-145為研究對象,通過生物信息學分析、文獻報道比較、3’RACE測序、細胞轉染、RT-qPCR、WesternBlotting、雙熒光報告分析等方法在牛乳腺上皮細胞中初步研究了bta-miR-145的功能。主要研究內容如下:1.為了挖掘更多的與bta-miR-145相關的信息,對bta-miR-145進行了生物信息學分析。通過MEGA5.05軟件對牛的bta-mir-145進行種系發育分析,發現牛與人和豬的microRNA145同源關系較近;通過miRTarBase數據對miR-145進行已驗證靶標收集,發現在人和小鼠上miR-145靶向IRS1;將TargetScan6.2預測的bta-miR-145的648個靶標帶入DAVID數據庫進行KEGG信號通路分析,發現大部分靶基因位于MAPK信號通路,其中包括IRS1;PicTar、miRanda、miRBase和miRGen這幾個預測軟件都預測到miR-145靶向IRS1,TargetScan6.2預測bta-miR-145靶向CSN2;通過RNAhybrid數據庫對IRS1和CSN2的bta-miR-145的預測結合位點進行最小自由能分析,發現自由能都小于-15kcal/mol。以上結果表明bta-miR-145可能靶向IRS1和CSN2,并調節MAPK信號通路。2.為了進一步確定bta-miR-145對牛的IRS1和CSN2基因的靶向關系,通過NCBI和Ensemble數據庫對這兩個基因進行3’UTR序列分析,結果發現牛的IRS1基因為預測基因,于是通過3’RACE的方法對牛IRS1的3’端進行快速擴增,然后利用Sequencher軟件對擴增片段進行拼接,獲得牛IRS13’UTR序列,進一步分析發現其上仍然存在預測的bta-miR-145的結合位點;CSN2基因的3’UTR序列在兩個數據庫中也有一些差異,但都存在預測的bta-miR-145的結合位點。3.為了獲取本研究的試驗模型,采用機械破碎法成功獲得增殖旺盛的原代牛乳腺上皮細胞,并對細胞進行純化,純化后的細胞及純化后傳二十代的細胞都檢測到角蛋白-18的表達,表明仍然具有上皮細胞的典型特征。采用不同激素和細胞因子誘導乳腺上皮細胞,發現100ng/mLIGF-1可顯著提高乳腺上皮細胞中β-酪蛋白的基因表達,為后續試驗提供了分泌功能的細胞模型。4.為了探索最佳的轉染條件,研究了細胞的接種密度、轉染時RNAi與脂質體的添加量、bta-miR-145的過表達和抑制表達效果,結果表明:以5×104-1×105/mL的密度接種細胞可以滿足轉染時細胞匯合率50%的要求;轉染時RNAi與脂質體2000選擇(30)(1.5)組合(24孔板),可以達到最佳轉染效率;150pmol/孔的mimic能夠達到過表達bta-miR-145的效果,300pmol/孔的inhibitor能夠達到抑制表達bta-miR-145的效果(6孔板)。5.為了研究bta-miR-145對牛乳腺上皮細胞增殖的影響,將牛乳腺上皮細胞接種于96孔板,48小時后利用CCK-8試驗盒進行檢測,結果表明bta-miR-145對牛乳腺上皮細胞生長具有一定的調控作用。6.為了研究bta-miR-145過表達和抑制表達是否會影響其它microRNA的表達,通過RT-qPCR的方法對bta-miR-214、bta-miR-181a、bta-miR-21進行檢測,發現bta-miR-181a與bta-miR-145呈相同的表達趨勢,bta-miR-214與bta-miR-145呈相反的表達趨勢,bta-miR-21基本不受bta-miR-145過表達和抑制表達的影響。7.為了研究bta-miR-145是否影響IRS1和CSN2的基因表達和蛋白表達,將bta-miR-145mimic和inhibitor轉染入牛乳腺上皮細胞中,利用RT-qPCR和Westernblotting方法分別檢測細胞中IRS1和CSN2的mRNA及蛋白表達的變化。結果表明Bta-miR-145影響牛IRS1、CSN2的蛋白表達,但并不影響它們的mRNA表達。8.為了研究bta-miR-145是否與IRS1和CSN2的3’UTR有相互作用,采用雙熒光報告基因載體pmiR-RB-REPORTTM構建分別含有IRS1、CSN23’UTR的重組載體,將此重組載體與bta-miR145mimic一起轉染入293T細胞。結果表明,以cel-miR-67作對照,bta-miR-145mimic沒有引起IRS1和CSN2雙熒光比值的明顯下調,因此,bta-miR-145可能對IRS1和CSN2的3’UTR并沒有明顯的相互作用。綜上所述,bta-miR-145對奶牛乳腺發育和泌乳有一定的調控作用,它可以調節牛乳腺上皮細胞的增殖,調節IRS1和CSN2的蛋白表達,但并不調節它們的基因表達,一種microRNA的表達變化會引起其它一系列的microRNA發生變化,應以系統生物學的觀點來解釋相關的生物學現象。
【作者】李文清;
【導師】王加啟;卜登攀;
【作者基本信息】中國農業科學院,動物營養與飼料科學,2014,博士
【關鍵詞】乳腺上皮細胞;bta-miR-145;增殖;IRS1;CSN2;

【參考文獻】
[1]李竹行.基于DEA的汽車整車物流成本控制研究[D].北京交通大學,2013.
[2]張賢洪.轉移印花原紙生產工藝技術[J].林產工業.2006(01)
[3]呂航,王風光,鮑凱鵬,李力.PCS-915母線保護裝置[J].電力系統自動化,2012,16:118-123.
[4]周鳳儀.60例多發性硬化的臨床特點及中醫證候特征的回顧性研究[D].廣州中醫藥大學,中醫學(專業學位),2013,碩士.
[5]王蕾.《發展漢語》中生詞的英語注釋問題[D].內蒙古師范大學,漢語國際教育(專業學位),2012,碩士.
[6]徐勝元,楊成梧.廣義系統在一般狀態反饋下的輸出穩定化[J].自動化學報,1999,06:841-843.
[7]鄧爽.基于空間美學的關中傳統村落外部空間分析研究[D].長安大學,城市規劃與設計,2014,碩士.
[8]武曉媛.城市社區思想政治教育工作研究[D].中北大學,思想政治教育,2014,碩士.
[9]蔣貴凰,李艷,鐘少穎.區域知識戰略定位方法研究——專利地圖法的應用[J].情報理論與實踐,2014,11:44-49.
[10]劉子麗.高中化學教材選修3中幾種常見晶體結構分析歸納[J].延邊教育學院學報,2014,05:125-127+129.
[11]寧濤.清初容美土司地區社會發展狀況研究[D].中南民族大學,歷史文獻學,2013,碩士.
[12]付天宇.基于深層發酵的羊肚菌功能性食品研究[D].吉林大學,食品科學與工程,2013,碩士.
[13]張燁.靜態圖像的感興趣區域壓縮編碼研究[D].蘇州大學,通信與信息系統,2003,碩士.
[14]陳慧.“生本教育”理念下閱讀課堂教學有效性的實踐研究[D].內蒙古師范大學,學科教學(專業學位),2013,碩士.
[15]董冬.論我國信訪工作中出現的法律問題及對策[D].湖北大學,憲法學與行政法學,2012,碩士.
[16]何立寶.深圳市HD科技有限公司員工滿意度實證研究[D].西南交通大學,工商管理(專業學位),2013,碩士.
[17]李多凌.線粒體相關代謝性肌病的生物化學、分子遺傳學發病機制和藥物治療機制研究[D].山東大學,神經病學,2014,博士.
[18]沈陽.資本投入對重慶市經濟增長的貢獻研究[D].西南政法大學,國民經濟學,2012,碩士.
[19]支國俊.基于Radius的網絡認證授權記賬系統的設計和實現[D].電子科技大學,軟件工程(專業學位),2012,碩士.
[20]張勇,史忠科,戴冠中,周自全.離散系統的魯棒最小方差濾波新算法及分析[J].自動化學報,2000,06:782-787.
[21]姚赟■.無奇之奇——試論“三言”中的時空設置及其審美意趣[J].漢語言文學研究,2014,02:80-88.
[22]胡猛.烏努格吐山銅鉬礦區環境評價與生態修復研究[D].吉林大學,環境科學,2013,碩士.
[23]郎曉旭.營運資本管理對企業績效影響的實證研究[D].東北師范大學,會計學,2012,碩士.
[24]周潤文.面向9-12歲兒童運動類玩具的設計研究[D].浙江工業大學,2012.
[25]錢怡云.采收加工貯藏方法對當歸藥材質量的影響及其定量分析模式研究[D].甘肅中醫學院,中藥學,2014,碩士.
[26]王玢佳.青海省互助縣小菜子溝滑坡成因與穩定性[D].中國地質大學(北京),地質工程,2014,碩士.
[27]卞蘇玲.馬克思主義生態思想視角下的蘇南地區生態文明建設研究[D].南京農業大學,馬克思主義基本原理,2013,碩士.
[28]張昶凱.兩種涂鐵改性砂的過濾性能及反沖洗條件研究[D].廣東工業大學,市政工程,2014,碩士.
[29]張州華.信貸工廠在東源泰業村鎮銀行三農信貸中的應用研究[D].蘭州大學,工商管理(專業學位),2013,碩士.
[30]劉芊芊.亞籍諾獎作家的民族身份認同研究[D].四川省社會科學院,文藝學,2014,碩士.
[31]王健.第一次世界大戰期間山東地區的華工招募[D].安徽大學,專門史,2014,碩士.
[32]徐東.金融投資決策模型研究[D].湖南大學,應用數學,2003,碩士.
[33]陳嘉寧,黃民翔,劉子秋,鐘宇峰,羌丁健.永磁直驅潮流能發電系統的建模及仿真[J].華東電力,2014,02:418-423.
[34]江麗.球坐標系下基于扇形柱體的地形改正研究與實現[D].中國地質大學(北京),地質工程,2014,碩士.
[35]杜杰敏.挖掘機耐磨鏟齒材質的研究[D].佳木斯大學,材料加工工程,2012,碩士.
[36]周玉慧.義和團運動時期的駐外公使研究[D].聊城大學,中國近現代史,2014,碩士.
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[38]張健康,粟小華,胡勇,李懷強.一起縱聯后加速保護誤動事故分析及對策[J].電力系統自動化,2011,07:97-101.
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[41]焦蘭淇.我國創業板信息披露監管制度研究[D].遼寧大學,法律,2012,碩士.
[42]張會娟,張首玉,邱聰,譚曉榮,惠明.一株產酯酵母的鑒定及發酵性能研究[J].河南工業大學學報(自然科學版),2015,02:23-27.
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[46]靳美娜.三種藥用植物化學成分及其生物活性研究[D].天津醫科大學,藥理學,2013,博士.
[47]姚葉.發展河北省碳排放權交易市場問題研究[D].河北經貿大學,產業經濟學,2014,碩士.
[48]王慶爽.中國民族聲樂藝術魅力[D].中國音樂學院,音樂學,2014,碩士.
[49]林芳芳,易筱筠,黨志,鄭劉春.改性花生殼對水中Cd~(2+)和Pb~(2+)的吸附研究[J].農業環境科學學報,2011,07:1404-1408.
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