大鼠同種異體腎移植前期急性排斥反應模型的建立及其預警標記物的篩選

大鼠同種異體腎移植前期急性排斥反應模型的建立及其預警標記物的篩選

作者:師大云端圖書館 時間:2015-11-23 分類:參考文獻 喜歡:2893
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【摘要】研究背景:腎移植已經成為終末期腎病患者的主要治療手段之一。隨著強有效的移植免疫研究及新型免疫抑制劑藥物的持續開發,使移植物的短期存活時間獲得了很大程度的提高,然而移植物長期存活率并沒有得到根本改善。影響移植腎存活的因素很多,主要分為移植前、后兩方面因素。移植前的因素主要包括腦死亡及器官缺血時間;移植后的因素中主要包括再灌注損傷、感染、排斥反應、腎毒性等。而導致上述相矛盾性結果的主要原因可能是1.等待腎移植的患者數量逐年增加導致供體腎臟總體質量下降;2.免疫抑制劑藥物的腎毒性;3.急性排斥反應或者慢性排斥反應發生的亞臨床癥狀的隱匿性增加等。其中急性排斥反應是腎移植術后最為常見的并發癥。移植腎功能的喪失意味著受者需要再次接受移植治療,這無疑會加重器官極度短缺的現狀及浪費更多的衛生資源。所以如果移植前腎損傷因素相同的情況下,移植后腎損傷應該降低到最低。因此,移植術后的實時監測特別是急性排斥反應的前期、及時監測與發現對改善移植腎臟功能、延長患者的長期存活以及降低醫療費用等能提供重要意義。目前腎移植術后腎功能的監測方法主要是1.通過常規檢查血清肌酐值,但是血清肌酐值的變化已經晚于移植腎功能相關蛋白的前期變化;2.細針穿刺活檢仍然是移植腎臟急性排斥反應診斷的“金標準”。但是,移植腎臟前期急性排斥反應的病理變化不明顯,因此病理診斷落后于移植腎臟本身前期已經發生的分子變化,這無疑會延誤患者的病情診斷及對受者術后有效性的干擾治療同時細針穿刺存在很多局限性,包括1.在短期內不能反復進行;2.可能導致移植腎臟急性損傷的發生;3.穿刺部位不準確導致的誤診及損傷鄰近器官;4.同時不利于受者的動態隨訪觀察。所以臨床醫生急需尋找一種無創、前期、安全、有效的方法來替代目前的檢查方法從而更準確的判斷急性排斥反應的發生并指導術后免疫抑制藥物的治療。針對這一需求,通過檢測受者血清及尿中相關標記物己成為該領域研究的熱點。無創性標記物的發現可能彌補上述不足,提供對移植術后免疫反應、組織損傷、免疫藥用治療等實現實時監測。以往報道中大部分的研究都集中在細胞毒性T細胞的效應蛋白及相關免疫分子上。然而,參與腎急性排斥反應的發生機制還有待于進一步闡明,可能還存在著其它因素的共同參與,比如炎癥、腎小管急性損傷、氧化應激等等。本課題主要通過監測同種異體腎移植大鼠模型中血清的NGAL,KIM-1,CRP,MDA以及sHLA-DR的變化,并試圖找出它們在腎移植大鼠中血清的表達與腎急性排斥反應早期發生的相關性,從而對大鼠早期腎急性排斥反應發生進行預警作用。而針對初學者而言如何快速、簡單、有效的建立大鼠腎急性排斥反應模型對于今后整個實驗的研究開展是至關重要的,也是整個實驗過程中首要的。此外,選擇大鼠同種異體腎移植模型有許多優點:它容易獲取,研究費用低,便于管理,且可以進行同源基因移植研究等。但是選擇大鼠同種異體腎移植模型也有不足,它表現為大鼠個體小,血管吻合難度大,一般需經過至少3個月的顯微外科訓練,限制了其研究應用,尤其是對初學者而言面臨著更大挑戰。我們通過文獻的學習以及多次反復的訓練改進,本課題還同時對大鼠同種異體腎移植模型方法進行了改進與評估,特別是供受體之間結合硬膜外導管內支架技術進行腎靜脈端端吻合,并與目前推薦的腎靜脈吻合方法進行比較。我們建立了一種穩定的、簡單、有效的大鼠腎移植模型,尤其是初學者容易掌握學習。目的:1、尋找一種穩定的、簡單、有效的大鼠同種異體腎移植模型,尤其適合初學者掌握學習,為大鼠腎移植急性排斥反應的研究開展提供首要的條件。2、探討同種異體腎移植大鼠模型中血清的NGAL、KIM-1、CRP、MDA以及sHLA-DR的變化,從而尋找出它們與大鼠早期腎急性排斥反應發生預警作用的關系。為大鼠早期腎急性排斥反應的監測及早期防治提供依據。方法:1.正常SD雄性大鼠為供體,Wistar雄性大鼠為受體,建立穩定的同種異體腎移植大鼠模型。。腎動脈采用端、側連續縫合,腎靜脈采用端端連續與間斷縫合,輸尿管采用膀胱瓣連續縫合,進行供、受體左側同種異體大鼠原位腎移植。對大鼠同種異體腎移植術后第3、4個月連續進行45次手術進行評估。2.雄性Wistar大鼠分別作為供者和受者,進行大鼠同種異體原位腎移植模型的建立。我們采用腎靜脈內置入硬膜外導管作為內支架進行端端吻合的方法,并進行方法改進,同時記錄同種異體腎移植大鼠移植后的生存率、熱缺血時間、腎靜脈吻合時間以及術中、術后的并發癥進行統計分析,并與目前多數文獻報道的大鼠供、受體之間腎靜脈吻合方法進行比較。并由兩個初學者參與實驗,每個初學者分別采用兩種方法連續進行30臺實驗。3.分別采用Brown-Norway(BN)原位腎移植到Lewis大鼠中作為實驗組以及Lewis大鼠原位腎移植到Lewis大鼠中作為對照組。并分別在同種異體腎移植術后第3、5、7天處死大鼠,每個亞組共重復五只,同時留取各組大鼠的血清標本用于檢測血清NGAL、KIM-1、CRP、MDA以及sHLA-DR的表達水平以及肌酐值,同時對移植物進行組織病理學切片染色。此外,我們還對移植物的NGAL蛋白進行評估分析。結果:1.按照文獻報道大鼠同種異體腎移植術后存活3天以上認為腎移植造模成功。統計第3、4個月造模練習結果,兩個月總共連續移植45次供受體手術。其中存活超過3天以上的受體為52只,成功率達86.7%;術后3天內死亡的受體數量為6只,分別為麻醉意外1只、低血容量1只、血栓2只、低體溫2只。受體腎動脈吻合時間(15±1.5min),腎靜脈吻合時間(15±1min),總時間(30±2min)。2.與目前推薦的大鼠腎靜脈吻合術相比較,初學者采用硬膜外導管的改良技術進行大鼠同種異體原位腎移植建模可以獲得較短的學習曲線。同時,兩種大鼠同種異體原位腎移植靜脈吻合術的術中并發癥及術后并發癥也進行評估分析。采用目前推薦的大鼠腎移植方法中,兩名初學者出現的并發癥分別為靜脈狹窄6例,血栓形成9例,吻合口滲漏7例,血管痙攣4例,腎靜脈損傷3例。而采用改良后的技術可以很好的減少上述并發癥的發生率。兩名初學者采用改良后的技術進行大鼠腎移植是發生的并發癥概率分別為腎靜脈狹窄0例,血栓形成3例,吻合口滲漏0,血管痙攣3例和腎靜脈血管1例。初學者采用兩種方法進行的大鼠腎移植中腎靜脈吻合并發癥的發生率有統計學差異(P<0.01)。3.在對照組中腎移植術后血清中NGAL、KIM-1水平第5、7天的值與第3天相比較,有所降低,但沒有統計學差異(P>0.05)。但是在實驗組中,大鼠同種異體腎移植術后血清中第3、5、7天NGAL和KIM-1水平較對照組有統計學意義(P<0.01),并且在實驗組第3、5、7天中它們的血清水平組內比較也有統計學意義(P<0.01)。大鼠同種異體腎移植術后對照組中血清CRP及MDA表達水平在腎移植術后第3、5、7天之間并沒有統計學意義(P>0.05)。而在實驗組中大鼠同種異體腎移植術后血清中第3、5、7天CRP及MDA表達水平較對照組有統計學意義(P<0.01)。此外,在本研究中,大鼠同種異體腎移植術后實驗組與對照組中血清HLA-DR水平沒有統計學意義(P>0.05)。但是它的血清表達有一定的波動性。結論:1.我們推薦初學者進行大鼠同種異體腎移植模型的建立組合是:腎動脈采用腹主動脈套囊端、側連續縫合,腎靜脈結合硬膜外導管以及端、端連續及間斷縫合,輸尿管采用膀胱瓣連續縫合,進行供、受體左側原位大鼠腎移植。它是一種穩定的、簡單的、有效的大鼠腎移植模型,初學者容易掌握學習。2.通過供受體之間的腎靜脈管腔內插入3mm長度硬膜外導管充當腎靜脈內支架管這一技術是一種簡單的、可靠的、有效的大鼠同種異體腎移植模型。它可以有效的縮短初學者對大鼠同種異體原位腎移植的學習曲線。此外,腎靜脈管腔內插入3mm長度硬膜外導管充當靜脈支架管的技術還可能應用到其他動物器官移植模型的腎靜脈吻合。3.通過檢測大鼠同種異體腎移植模型血清中NGAL、KIM-1、CRP和MDA含量的表達水平可能對大鼠同種異體移植模型中前期腎急性排斥反應進行提前預警。它們在血清中的異常表達要早于大鼠同種異體腎移植急性排斥反應組織病理學上的變化及其肌酐的變化。從而可以讓我們在早期就可以對大鼠同種異體急性排斥反應的發生進行提前干預,進一步減少急性排斥反應帶給大鼠同種異體腎移植物的損害,從而增加大鼠同種異體移植腎的存活率及其早期預防移植術后并發癥的發生。
【作者】葉東明;
【導師】蘇澤軒;
【作者基本信息】南方醫科大學,外科學,2014,博士
【關鍵詞】大鼠;腎移植;急性排斥反應;模型;標記物;

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